F. O`Valle Ravassa, A. Pelegrina Jiménez, N. Navarro Martínez, M J. García-Chicano
Introducción
La eficacia de los análogos de los nucleótidos (AN) en el tratamiento de la infección VIH tiene una duración limitada, determinada fundamentalmente por la aparición de mutaciones en la región pol del genoma, que codifica la transcriptasa inversa (TI) del VIH y que confieren resistencia a diferentes AN, tanto de los empleados en clínica habitualmente, como son la zidovudina (AZT), dideoxiinosina (ddI) y dideoxicitosina (ddC), como frente a aquellos que se encuentran en fase experimental (Richmann, 1993).
La posibilidad de aparición de resistencia a antirretrovirales mediada por la expresión de glicoproteína P-170 (Gp-P) en la superficie de los linfocitos CD4, que conduciría a un descenso de la concentración intracelular de estos fármacos, ha sido objeto de escasa atención hasta la fecha. En este sentido, se ha demostrado "in vitro" que la infección VIH induce un incremento de la Gp-P en monocitos y células T y, así mismo, que la expresión de Gp-P reduce la actividad del AZT (Antonelli et al, 1992; Gollapoudi & Gupta, 1993).
Por otra parte, en biopsias renales postrasplante nuestro grupo ha demostrado que existe asociación entre los depósitos de CsA y la sobreexpresión de Gp-P (García del Moral et al, 1995) lo cual podría condicionar la aparición de crisis de rechazo resistentes a CsA en pacientes con una respuesta excesiva de Gp-P en los linfocitos CD4 (Gómez-Morales et al, 1995).Este hecho ha sido demostrado en los linfocitos de pacientes trasplantados cardíacos con rechazo refractario al tratamiento así como en biopsias de casos con trasplante pulmonar y crisis de rechazo resistente a esteroides (Yousem et al, 1993).
De hecho sobre linfocitos normales se ha descrito que la capacidad para depurar de su citoplasma diversos agentes fluorescentes (rodamina 123) parece estar vinculada a la existencia de dicha glicoproteína, habiéndose observado adicionalmente diferencias entre las distintas subpoblaciones linfocitarias respecto a esta capacidad, que es mayor en las células CD8 y CD4 que en los linfocitos CD20 de naturaleza B. Sin embargo en individuos no sometidos a tratamiento farmacológico en porcentaje total de linfocitos que poseen cantidades detectables de Gp-P por citometría de flujo no supera el 15% (Drach et al, 1992). Todo ello sugiere que el fenotipo MDR puede jugar un importante papel en la regulación del tráfico de sustancias que intervienen en la función leucocitaria (Coon et al., 1991; Schluesener et al., 1992).
Expresión de glicoproteína P sobre linfocitos en un modelo de intoxicaciàn crànica por ciclosporina A en la rata y su regulaciàn por la ingesta salina.
La ciclosporina A (CsA) es una droga de amplio uso clínico por su actividad inmunosupresora. Aunque el mecanismo preciso de su acción farmacológica no es del todo conocido parece que esta molécula hidrofóbica se une a un receptor citoplásmico -ciclofilina-, perteneciente a la familia de las inmunofilinas (Theriault et al, 1993). Posteriormente el complejo CsA-ciclofilina se une a la calcioneurina inhibiendo su actividad fosfatasa (Fruman et al, 1992), lo cual modifica la expresión de diversas proteínas nucleares reguladoras de la trascripción de los genes de activación de los linfocitos T, fundamentalmente los que codifican ciertas citoquinas como la IL-2 (Yoshimura et al, 1987), protooncogenes como H-ras y c-myc y receptores de citocinas como la cadena ß o receptor de alta afinidad para IL-2 (Herol et al 1986).
Aparte de su actividad inmunosupresora otra propiedad conocida de la molécula de ciclosporina es que posee la capacidad de revertir el fenómeno de multirresistencia a drogas (MDR) en células tumorales (Twentyman, 1992) a través de su unión con la Gp-P. Este efecto lo poseen también otros fármacos entre los que se encuentran el verapamil y otros agentes bloqueantes de los canales del calcio. A pesar de este efecto, en líneas celulares permanentes existen evidencias experimentales que demuestran la inducción de Gp-P por CsA (García del Moral et al, 1995).
Por otra parte se ha demostrado que la Gp-P posee una acción complementaria sobre la regulación del volumen celular a través de una actividad de transporte transmembrana de iones de cloro (Gill et al, 1992) y que su presencia puede ser inducida por choque salino hipertónico sobre células en cultivo (Wei and Roepe, 1994).
El estudio fue realizado sobre 30 ratas macho Spragüe-Dawley, de 6 semanas, estabuladas en condiciones estándar y divididas en dos grupos de 15 animales, a uno de los cuales se le suministró una dieta desprovista de sodio (UAR 212, UAR Francia). A su vez, 5 animales de cada grupo recibieron CsA (Sandoz Pharma, Basel, Switzerland) disuelta en propilenglicol mediante bombas osmóticas Alzet (USA), tipo 2004, implantadas por vía subcutánea y recambiadas a los 30 días de la experiencia. La duración de la experiencia fué de 60 días. Las bombas garantizan una liberación homogénea del fármaco de 2.5 æL/hora, ajustándose la concentración de fármaco a 25 mg/Kg/día. A los restantes animales se les implantó igualmente una bomba osmótica conteniendo propilenglicol al 85% en etanol absoluto (5 ratas) o suero fisiológico (5 ratas). Siete de los animales que recibieron el fármaco estaban bajo una dieta desprovista de sodio.
La glicoproteína P en la superficie linfocitaria se estudió por citometría de flujo mediante técnica de inmunofluorescencia indirecta empleando el anticuerpo monoclonal JSB-1 (Monosan, USA) a partir de una extracción de sangre realizada de la vena yugular. Para la determinación de Gp-P con el AcMo JSB-1 se partió de una suspensión de 106 células en 100 µL. Las muestras se analizaron en un citómetro Cytoron Absolute (Ortho, USA). Algunos comentarios adicionales merece el procedimiento empleado de fijación-permeabilización celular con PermeafixR (Ortho).
En nuestra experiencia, la reciente introducción en el mercado español del producto Permeafix(R) supuso en el caso de este modelo experimental en rata que los resultados comenzaran a ser constantes y reproducibles, ya que induce una mínima inespecificidad o fijación inespecífica con mínima contaminación del "gate" correspondiente a linfocitos por parte de monocitos y granulocitos. Este hecho en gran medida es debido a la perfecta conservación de la forma de los linfocitos, con escasa presencia de artefactos tal y como ha sido comunicado por nuestro grupo en la anterior ponencia.
En cuanto a los resultados obtenidos se detectó positividad para Gp-P en todas las muestras analizadas. Los porcentajes de linfocitos positivos para Gp-P obtenidos en cada uno de los grupos estudiados se especifican en la tabla 1. Las cifras más elevadas de linfocitos que expresan Gp-P se obtuvieron en el grupo de ratas tratadas con CsA y sometidas a dieta de mantenimiento (61.3ñ 11.3) y las más bajas correspondieron al grupo de animales tratados con suero fisiológico y sometidos a dieta desprovista de sodio (27.4 ± 10.4). Se obtuvieron diferencias significativas entre los resultados obtenidos en el grupo de ratas tratadas con CsA y sometidas a dieta de mantenimiento con respecto a los grupos restantes: CsA y dieta sin sal, suero fisiológico y dieta sin sal (p<0.01); para todos los demás la significación fue < 0.05 (tabla 1).
Tabla 1. Expresión de Gp-P en linfocitos de sangre periférica de rata ¡¡¡¡ FALTA TABLA !!!!
TRATAMIENTO MEDIAñDE CMFñDE NORATAS SIGNIFICACl¢N
(% cel.) ESTADÖSTICA
S. FISIOLàGICO 37.5ñ20 9.45ñ6.7 4
DIETA CON SAL
1S. FISIOL¢GlCO 27.4ñ10 6.9ñ1.2 4
DIETA UAR 212b
CsA 61.3ñ11 15.2ñ1.4 4 p
DE: Desviación estándar. CMF: Canal medio de fluorescencia
Nuestro trabajo es el primer estudio experimental que demuestra
mediante citometría de flujo el efecto inductor de la CsA sobre la
Gp-P en linfocitos de sangre periférica de rata. Este método es más
fidedigno que la immunohistoquímica convencional ya que: 1) permite
una mejor objetivación de los resultados, 2) analiza un
número muy alto de células, 3) permite tipificar
células que expresan el Ag con seguridad y no basándose en una
apreciación subjetiva de la morfología y 4) puede revelar cambios
mínimos en el número de moléculas del antígeno,
únicamente reconocibles por los cambios inducidos sobre el canal
medio de fluorescencia.
Este efecto inductor de Gp-P por CsA podría estar relacionado
con el desarrollo de crisis de rechazo resistentes a la CsA como se
comentará posteriormente.
Una contribución importante de nuestro estudio es la
demostración de que el aporte salino de la dieta modifica la
expresión de Gp-P inducida por CsA. En este sentido se ha demostrado
recientemente en cultivos celulares de líneas humanas, que el pH
ácido y el choque hipertónico incrementan la expresión
de proteínas MDR (Wei and Roepe, 1994). De hecho, el producto del
gen de la fibrosis quística (CFTR) y la Gp-P pertenecen a una
familia de proteínas (ABC) que poseen actividad reguladora de los
canales del cloro (Higgins, 1992; Gill et al, 1992). El CFTR interviene en
la regulación del volumen celular (Riordan et al, 1990). Sin embargo es
controvertido si la Gp-P tiene también este efecto (Valverde et al, 1992),
aunque algunos estudios más específicos postulan que las funciones
reguladoras de los canales del Cl- y detoxificante que posee la Gp-P son
independientes una de otra, pudiéndose afirmar que la Gp-P es una
proteína bifuncional (Gill et al, 1992).
En función de todo lo expuesto, creemos que nuestros
resultados abren nuevas perspectivas clínicas en el sentido de que
modificaciones en la cantidad de sal ingerida con la dieta pueden regular
la expresión de Gp-P y por tanto tener efecto sobre la aparición de crisis
de rechazo resistentes al tratamiento inmunosupresor.
Expresión de glicoproteína P en linfocitos humanos
normales y de pacientes trasplantados renales.
Con la finalidad de comprobar la extrapolación del modelo
experimental comentado a la patología humana se ha estudiado la
expresión de Gp-P en linfocitos humanos normales y de pacientes en
hemodiálisis y trasplantados renales. Estos resultados ponen de
manifiesto que la expresión media (% de células positivas) de Gp-P en
linfocitos de sujetos normales es 11.8±5.2 mientras que los pacientes
en hemodiálisis presentan unos valores medios de 22.5ñ13.8 y los
enfermos trasplantados valores superiores de 38.6±16.2. Estas
diferencias son estadísticamente significativas (Anova p<0.01),
especialmente al comparar la expresión en linfocitos de los
pacientes trasplantados frente a los sujetos sanos (Newman Keuls,
p<0.05) y en hemodiálisis (Newman Keuls, p<0.01).
La sobreexpresión de Gp-P inducida por la CsA es probablemente
variable de unos individuos a otros. Este hecho guardaría relación con la
existencia de tipos individuales de respuesta a este fármaco (Lemaire et
al, 1990). Nuestro grupo ha demostrado en estudios previos y tanto en la
línea celular de ri¤ón de perro -MDCK- como en biopsias renales
postrasplante que la Gp-P está sobreexpresada cuando existen grandes
depósitos intracelulares de CsA. (García del Moral et al, 1995) y que los
enfermos que presentan en sus biopsias depósitos importantes de CsA tienden
a hacer crisis de rechazo más graves (Gómez-Morales et al, 1995), a lo que
se sumaría el efecto tóxico del acúmulo de CsA. Los resultados de estos
estudios sugieren que determinados individuos pueden tener déficit
funcionales en los mecanismos de detoxificación celular, lo que
llevaría al acúmulo de CsA intracelular. Por otra parte una respuesta
detoxificante excesiva conduciría a rechazos resistentes a CsA
(García del Moral et al, 1995).
En este sentido, en enfermos con trasplante cardíaco y
pulmonar que
sufrieron crisis de rechazo, se ha demostrado una sobreexpresión de Gp-P
en linfocitos de sangre periférica y células mononucleares
del injerto respectivamente (Kemnitz et al, 1991; Yousem et al, 1993).
Expresión de glicoproteína P en linfocitos de
pacientes con infecciàn VIH y en tratamiento crànico con AZT.
En los estudios preliminares realizados la expresión de Gp-P
en linfocitos de sangre periférica es superior en enfermos con SIDA
sometidos a diversos tratamientos (27.8%) que en los sujetos control
(11.8%) (t de Student, p<0.05).
BIBLIOGRAFÍA:
ANTONELLI G, TURRIZIANI O, CIANFRIGLIA M, RIVA E, DONG G, FATTOROSSI A, DIANZANI F. Resistance of
HIV-1 to AZT might also involve the cellular expression of multidrug resistance P-glycoprotein. AIDS Res
Hum Retroviruses 1992; 8: 1839-1844.
COON JS, WANG YZ, BINES SD, MARKHAM PN, CHONG AS, GEBEL HM. Multidrug resistance activity in human
lymphocytes. Hum Immunol 1991; 32:134-140.
DRACH D, ZHAO S, DRACH J, MAHADEVIA R, GATTRINGER C, HUBER H, ANDREEFF M. Subpopulations of normal
peripheral blood and bone marrow cells express a functional multidrug resistance phenotype. 1992; 80:
2729-2734.
FRUMAN DA, KLEE CB, BIERER BE, BURAKOFF SJ: Calcioneurin phosphatase activity in T-lymphocytes is
inhibited by FK-506 and cyclosporin A. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: 3686-91.
GARCIA DEL MORAL R, O'VALLE F, ANDUJAR M, AGUILAR M, LUCENA MA, LOPEZ-HIDALGO J, RAMIREZ C, MEDINA-CANO
MT, AGUILAR D, GOMEZ-MORALES M: Relationship between P-glycoprotein expression and cyclosporin A in
kidney. An immunohistological and cell culture study. Am J Pathol 1995; 146: 398-408.
GILL DR, HYDE SC, HIGGINS CF, VALVERDE MA, MINTENIG GM, SEPULVEDA FV. Separation of drug transport and
chloride channel functions of the human multidrug resistance P-glycoprotein. Cell 1992; 71:23-32.
GOLLAPUDI S, GUPTA S. P-Glycoprotein (MDR-1 Gene Product) in Cells of the Immune System - Its Possible
Physiologic Role and Alteration in Aging and Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1) Infection. J Clin
Immunol 1993; 13: 289-301.
GOMEZ-MORALES M, BUSTOS M, MONTES A, ANDUJAR M, MEDINA-CANO MT, RAMIREZ C, O`VALLE F, AGUILAR D, ANEIROS
J, GARCIA DEL MORAL R: Influence of intrarenal deposits of Cyclosporin A on acute renal transplant
rejection. Nephron (in press).
GUPTA S. KIM CH. TSURUO T. GOLLAPUDI S. Preferential expression and activity of multidrug resistance
gene 1 product (P-glycoprotein), a functionally active efflux pump, in human CD8+ T cells: a role in
cytotoxic effector function. J Clin Immunol. 1992; 12: 451-458.
HEROLD KC, LANCKI DW, MOLDWIN RL, FITCH FW. Immunosuppressive effects of cyclosporin A on cloned T cells.
J Immnunol 1986; 136: 1315-1321.
HIGGINS CF. ABC transporters: from microorganisms to man. Annu Rev Cell Biol 1992; 8: 67-113.
LEMAIRE M, FAHR A, MAUER G: Pharmacokinetics of cyclosporine: inter-and intra-individual variations and
metabolic pathway. Transpl Proc 1990; 22: 1110-1112.
KEMNITZ J, UYSAL A, HAVERICH A, HEUBLEIN B, COHNERT TR, STANGEL W, GEORGII A. Multidrug resistance in
heart transplant patients: a preliminary communication on a possible mechanism of therapy-resistant
rejection. J Heart Lung Transplant 1991; 10: 201-210.
RICHMAN DD. Resistence of clinical isolates of human inmunodeficiency virus to antiretroviral agents.
Antimicrob Agents Chemother. 1993; 37: 1207-1213.
RIORDAN JR, ROMMENS JM, KEREM B-S, ALON N, ROZMAHEL R, GRZELCZAK Z, ZIELENSKI J, LOK S, PLAVASKI N, CHOU
J-L, DRUMM ML, IANNUZZI MC, COLLINS FS, TSUI L-C. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and
charaterization of complementary DNA. Science 1990; 245:1066-1073.
SCHLUESENER HJ, KOEPPEL C, JUNG S. Multidrug transport in human autoimmune T line cells and peripheral
blood lymphocytes. Immunopharmacology 1992; 23: 37-48.
THERIAULT Y, LOGAN TM, MEADOWS R ET AL: Solution structure of the cyclosporine A/cyclophilin complex by
NMR. Nature, 1993; 367: 88-
TWENTYMAN PR. Cyclosporins as drug resistance modifiers. Biochem Pharmacol 1992; 43: 109-117.
VALVERDE MA, DIAZ M, SEPULVEDA FV, GILL DR, HYDE SC, HIGGINS CF. Volume-regulated chloride channels
associated with the human multidrug-resistance P-glycoprotein. Nature 1992; 355: 830-833.
WEI L-Y, ROEPE PD. Low external pH and osmotic shock increase the expression of human MDR protein.
Biochemistry 1994; 33:7229-7238.
YOSHIMURA R, OKA T, CLARK SC, KAHAN BD: The inhibition of interleukin 2 (IL-2) gene expression at the
level of messenger RNA by in vivo cyclosporine treatment in kidney transplant recipients . Transplant
Proc 1987; 11: 3510-15.
YOUSEM SA, SARTORI D, SONMEZ-ALPAN E. Multidrug resistance in lung allograft recipients: possible
correlation with the development of acute and chronic rejection. J Heart Lung Transplant. 1993; 12:
20-26.