El análisis funcional in situ del comportamiento mitocondrial ha recibido una atención sustancial en los últimos años. La mitocondria desempeña un papel clave en el metabolismo energético celular y, por otra parte, es diana de numerosos agentes tóxicos, entre los que se incluyen toxinas naturales, inhibidores experimentales y fármacos. Recientemente, se ha puesto de manifiesto la importancia de las alteraciones del metabolismo mitocondrial en el mecanismo de muy diversos fenómenos relacionados con el envejecimiento y muerte celular.

Los estudios funcionales del comportamiento mitocondrial se han beneficiado del diseño de fluorocromos que marcan selectivamente las mitocondrias, gracias a diferentes mecanismos moleculares y a condiciones experimentales definidas que aseguran la especificidad de la unión a dichos org nulos:

1. Unión específica a la membrana mitocondrial: la membrana mitocondrial se caracteriza por su elevado contenido en el fosfolípido cardiolipina. Los derivados acilados del naranja de acridina, Nonil-naranja de acridina (NAO) y Dodecil-naranja de acridina (DAO) se unen específicamente a las mitocondrias, independientemente de su estado energético y son aplicables a células intactas o fijadas. Estos derivados, tóxicos a altas concentraciones, permiten la visualización del comportamiento mitocondrial al microscopío de fluorescencia o confocal y la cuantificación del contenido mitocondrial en células individuales por citometría de flujo. Se excitan a 488 nm (luz azul, láser de argón) y emiten en el verde-naranja, con elevado rendimiento cuántico.

2. Acumulación específica en las mitocondrias: la estructura vectorial de la cadena de transporte electrónico mantiene un potencial de membrana mitocondrial (PMM), negativo al interior, miles de veces superior al potencial de la membrana plasmática. Una serie de fluorocromos lipofílicos y de naturaleza catiónica se acumulan selectivamente en el interior de las mitocondrias activas atraídos por el elevado PMM. Entre los fluorocromos sensibles al PMM destacan las rhodaminas, las rhosaminas, las carbocianinas y los derivados del estirilo. La mayoría de estos fluorocromos son sencillos de utilizar en citometría de imagen y de flujo, se excitan a 488 nm y emiten en el verde- naranja. Recientemente, se ha sintetizado un fluorocromo derivado de la benzimidazolcarbocianina (JC-1), que se excita a 488nm y mide el PMM a través del cociente de emisiones naranja/verde (alto PMM/bajo PMM), aunque este fluorocromo es más complejo y relativamente tóxico.

El uso de fluorocromos catiónicos permite la excelente visualización del compartimento mitocondrial y la cuantificación del PMM por citometría de flujo en células intactas, protoplastos, vesículas sinaptosómicas e, incluso, en mitocondrias aisladas individuales.

La mayor parte de los estudios citométricos del compartimento mitocondrial se han llevado a cabo con el fluorocromo Rhodamina-123 (Rh123), por sus especiales características de solubilidad, baja toxicidad y rendimiento cuántico. Sin embargo, en muchos casos, las condiciones experimentales son más adecuadas para la simple visualización microscópica que para el análisis cuantitativo por citometría de flujo.

En nuestro laboratorio se utiliza un método cinético desarrollado por nosotros (Juan et al., Cytometry 15 335-342,1994) basado en la captación de muy bajas concentraciones de Rh123. Con este método, sencillo, rápido y sensible, es posible analizar ventajosamente el PMM y sus alteraciones, incluso las ligeras o transitorias, en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. Se presentan ejemplos de la aplicación de este método al estudio selectivo de vías metabólicas oxidativas, a la comparación funcional entre hepatocitos normales y transformados, al estudio del envejecimiento y al análisis de los fenómenos bioquímicos en modelos de muerte celular por apoptosis.