La epifluorescencia constituye una de las técnicas de microscopía óptica más utilizadas actualmente en el área de la investigación biomédica. Su desarrollo es debido, por un lado, a la progresiva optimización de las técnicas de tinción y marcaje con fluorocromos y, por otro lado, al aumento del poder de resolución óptica proporcionado por el uso del microscopio confocal.

La configuración actual de este tipo de microscopio está basada en la propuesta original de Marvin Minsky (1957), aunque la comercialización del primer equipo se realiza por primera vez en 1988. Está definido por las siguientes características: a) disponer de una fuente de iluminación puntual focalizada en cada momento sobre un sólo punto de la preparación; b) la fluorescencia emitida por el punto iluminado accede al detector atravesando una apertura o diafragma (pinhole) que excluye la luz emitida por elementos situados en puntos alejados del plano focal; c) la imagen bidimensional (ejes x e y) del objeto situado en el plano focal se obtiene mediante el barrido de la preparación con la luz puntual.

I.-Instrumentación: en la construcción de estos microscopios destacan:

a) Fuente de iluminación: todos los microscopios confocales utilizan el láser por sus propiedades de intensidad lumínica, selección de longitud de onda y uniformidad (emisión continua). Los más frecuentes son los de argón (...=488 y 514 nm), Krypton (...=568 y 6647 nm) y helio- neón (...=543 y 633 nm) para iluminar en el espectro de la luz visible. La iluminación ultravioleta (UV) está incorporada sólo en algunos equipos, ya que requiere un láser especial de argón o de helio-cadmio y, cromáticas significativas cuando transmite luz ultravioleta.

b) Sistema óptico: el criterio de selección de los espejos, filtros y objetivos depende de un factor denominado "eficacia de transferencia óptica", parámetro que corresponde a la relación entre la intensidad de la imagen producida por el objeto y la intensidad de la luz incidente. Su valor es dependiente de la longitud de onda de la luz y de las caracter¡sticas de reflectancia de los espejos y filtros. Los objetivos más adecuados son los que combinan las características de reflectancia de los espejos y filtros. Los objetivos más adecuados son los que combinan las características de alta apertura numérica, alta eficacia de transferencia óptica y estar libres de aberraciones cromáticas.

c) Microscopio y accesorios: la elección del microscopio debe estar basada en caracter¡sticas de solidez mecánica, facilidad de uso y coste económico. En todos los casos es necesario incorporar platina motorizada que permitirá la obtención de secciones ópticas seriadas destinadas a la reconstrucción tridimensional de las estructuras de interés.

II.-Preparación de las muestras: es idéntica a la empleada para microscopía de fluorescencia convencional y/o citometría de flujo en cuanto a los métodos de fijación y de tinción o marcaje. Es importante recordar algunos aspectos:

a) Fijación: cuando sea necesaria, deberá respectar los lugares de reconocimiento del anticuerpo y minimizar la presencia de artefactos. En general, son inadecuados aquellos fijadores como el glutaraldehído, que exageran la autofluorescencia de la muestra. En general, son adecuados el paraformaldeh¡do (4% en solución salina isotónica) y metanol o acetona fríos (-20ºC).

b) Secciones histológicas: el grosor depende de la distancia de trabajo propia para cada objetivo, de la penetrabilidad del anticuerpo o de los fluorocromos empleados en la tinción y de las propiedades de transparencia de las estructuras histológicas que componen la muestra.

c) Atenuación de la fluorescencia: además de limitar el tiempo de observación, los radicales libres producidos durante el período de excitación del fluorocromo dañan las células y tejidos no fijados (ej. células en cultivo).

d) Conservación de las muestras: deben ser protegidas de la luz, analizadas tan pronto como sea posible y almacenadas en fr¡o.

III.- Obtención de la imagen:

La mayor parte de los microscopios confocales comercialmente se suministran con el software necesario para el procesamiento de la imagen digital. Son importantes las opciones que permiten mejorar la calidad de la imagen mediante la reducción del ruido de fondo (aplicando filtros para las intensidades bajas de fluorescencia) o incrementando el contraste de la imagen digital. Para las reconstrucciones tridimensionales a partir de secciones ópticas seriadas, es aconsejable que el intervalo entre secciones sea, al menos, la mitad de la resolución axial. Además, el intervalo entre secciones debe ser interpolado hasta que el voxel sea c£bico. En definitiva, tomando en consideración estos aspectos, el microscopio confocal puede aumentar el poder de resolución, la sensibilidad y las posibilidades analíticas de los métodos inmunohistoquímicos y de tinción con fluorocromos. Es una técnica disponible que progresa en la medida en que surge la necesidad de una respuesta en cualquiera de los campos de la investigación biomédica.