La capacidad de las células eucariotas de adoptar una gran variedad de formas y de realizar multitud de funciones especializadas depende de las relaciones espaciales y temporales que se establecen entre sus elementos constituyentes. El reto actual de la Biología Celular es el de conocer en profundidad como se establecen estas relaciones y que elementos moleculares participan en ellas. Para alcanzar este objetivo es necesario disponer herramientas metodológicas adecuadas que permitan detectar los sistemas moleculares responsables de la gran versatilidad celular. En la actualidad, los biólogos celulares disponemos de una gran diversidad de técnicas, altamente potentes, que permiten responder experimentalmente a prácticamente todas las cuestiones que se plantean.

Dentro del conjunto de estas técnicas, destacan los métodos de epifluorescencia, la cual es una de las técnicas más comúnmente utilizadas en la investigación biológica y que ha contribuido al renacimiento actual de la microscopía óptica. Una de las razones más importantes del auge actual de la epifluorescencia lo representa el desarrollo de los métodos de imunofluorescéncia, donde la especificidad de los anticuerpos se utiliza como base para la tinción específica de los elementos moleculares. Pero también porqué se han desarrollado nuevos marcadores fluorescentes, como los indicadores de concentración de Ca2+, los de pH intracelular o los de potencial de membrana, etc., que además de poder visualizar en que momento y lugar se producen cambios iónicos, permiten cuantificar dichos cambios y estudiar posibles fenómenos reguladores. Además, cada día se utilizan más las estrategias experimentales basadas en la microinyección de proteínas, de oligonucleótidos o de lípidos marcados con fluorocromos. El material biológico esta organizado en cuatro dimensiones; tres espaciales y una temporal. La epifluorescencia, a pesar de su indudable potencialidad, tiene importantes limitaciones. Por una parte las imágenes que se obtienen sólo están referidas sobre dos dimensiones espaciales. Pero, además, uno de los problemas más severos lo representa el hecho que las imágenes que se obtienen se generan en base a las se¤ales procedentes no sólo del plano de foco, sino también a partir de las señales que proceden de estructuras situadas por encima y por debajo del plano de foco. El resultado es que a menudo, y especialmente en estructuras gruesas, se produce un ruido de fondo que degrada la imagen. Se han utilizado varios métodos alternativos para evitar esta dificultad. Uno de estos métodos podría ser el uso de células aplanadas, pero esta forma celular es poco frecuente en la naturaleza y nunca se mantiene durante la división celular. Otro método alternativo podría ser la obtención y tinción de secciones, pero esto introduce dificultades técnicas y problemas en la interpretación tridimensional de las estructuras. Otra y quizás la solución más definitiva a las limitaciones de la epifluorescencia lo representa la microscopía confocal. La microscopía confocal ofrece varias ventajas sobre las microscopías ópticas y electrónicas convencionales. Primero, la profundidad de campo (0,5-1,5 um) del microscopio confocal proporciona información a partir de una sección óptica muy definida, en lugar de toda la muestra tal y como sucede en la epifluorescéncia o la microscopía óptica convencional. En consecuencia, se eliminan prácticamente todas las señales procedentes de fuera del plano de foco, lo cual además de evitar la degradación de la imagen incrementa el contraste y la sensibilidad de la detección. Segundo, el microscopio confocal secciona ópticamente las muestras de modo que quedan eliminados los artefactos producidos mediante los métodos convencionales que se producen con los métodos físicos de seccionamiento. Dado que el seccionamiento óptico no es invasivo, se pueden observar muestras vivas al igual que muestras fijadas, con mayor claridad. Tercero, el microscopio confocal puede realizar secciones no sólo en el plano xy (perpendicular al eje óptico del microscopio), sino también verticalmente (paralelo al eje óptico) en los planos xz o bien yz. Con el seccionamiento vertical (xz o yz) las células se barren en profundidad (eje z) y también lateralmente (ejes x o y), generando imágenes en paralelo al eje óptico del microscopio. Esto da información del plano focal a partir del lado de la muestra y puede mostrar variaciones en altura. Por último, las secciones ópticas tomadas en los sucesivos planos focales (conocidas como series z) pueden ser reconstruidas informaticamente para producir una visión tridimensional de la muestra. Por lo tanto la microscopía confocal no sólo proporciona una potente herramienta intermedia por sus prestaciones entre la microscopía óptica y electrónica, sino que también proporciona un medio para la observación y detección de los elementos moleculares de las células vivas en sus cuatro dimensiones organizativas. Las aplicaciones de la microscopía confocal en la resolución de los problemas planteados por biología celular actual son prácticamente ilimitadas. Durante los £ltimos a¤os, nuestro grupo de investigación ha utilizado la microscopía confocal en varios aspectos relativos al conocimiento de la organización y dinámica intracelular. Como ejemplos de dicha utilización se presentan resultados referentes a 1) Los mecanismos que regulan la organización de los proteoglucanos de la superficie celular. Mediante la utilización de la microscopía confocal se ha podido establecer de manera inequívoca que los proteoglucanos se hallan distribuidos en la membrana plasmática por medio de su relación con los filamentos de actina de un modo altamente organizado y en función de su unión a los ligandos extracelulares, y 2) Los mecanismos que regulan y dirigen el correcto tráfico intracelular de proteínas de secreción. El empleo de la microscopía confocal ha permitido conocer el destino final que diferentes proteínas de secreción mutantes con alteraciones en uno de sus restos aminoácidicos siguen en respuesta a los sistemas de control de calidad que la célula posee para evitar la secreción de proteínas anómalas.