En Salmonella enterica serovar enteritidis se ha descrito la presencia de un plásmido de 60,15 Kb relacionado con la patogenicidad de esta bacteria. Sin embargo, se han aislado cepas responsables de brotes muy virulentos que carecen de este plásmido, pero que son portadoras de un plásmido de pequeño tamaño (5.7 Kb).

La caracterización de este plásmido, al que hemos denominado pFM366, se inició con la búsqueda de promotores funcionales. Con este propósito se hicieron fusiones transcripcionales entre distintos fragmentos del plásmido y el gen´LacZ delecionado en la región promotora.

Se midió la actividad B-galactosidasa de los plásmidos resultantes mediante citometría de flujo utilizando, como sustrato del enzima Fluoresceín-di-B- Galactopiranósido (FDG). La acción del enzima sobre el FDG, libera fluoresceína que es detectada por el citómetro y cuantificada. Mediante esta técnica se localizaron en una región de 533pb dos promotores solapados. Estos dos promotores codifican, en sentido divergente, dos proteínas, una endonucleasa y una 5-metilcitosina, que constituyen un sistema de restricción-modificación tipo II (R-M-II).

A partir de las fusiones transcripcionales de los dos promotores con el gen´LacZ se analizó, utilizando la citometría de flujo y FDG, la expresión de estas proteínas a lo largo de la curva de crecimiento. En este ensayo se utilizaron dos cepas isogénicas, una de ellas portadora de una mutación en el gen katF. El producto de este gen es un factor “ (RpoS) de la RNA polimerasa responsable de la síntesis de algunas proteínas en fase estacionaría. Se observó una baja expresión de B- galactosidasa en la fusión con el promotor de la endonucleasa en comparación con la fusión del promotor de la metilasa. Estos resultados muestran que la restrictasa debe estar estrechamente regulada, como ya han indicado otros autores. Los dos promotores parecen estar regulados por KatF ya que la expresión del enzima B-galactosidasa aumenta en presencia de este factor ô. Sin embargo, estos ensayos se han realizado en multicopia y hay que confirmarlos con los que se obtengan en monocopia. Existen numerosos factores que pueden afectar a la síntesis protéica. Uno de ellos es el pH intracelular y extracelular, sobre todo en estas bacterias que, al ser patógenos intracelulares, son capaces de resistir pH ácidos dentro de los macrófagos, por lo que hemos intentado poner a punto la medición del pH intracelular. En células eucariotas el estudio del pH intracelular se puede realizar por citometría de flujo utilizando una gran variedad de fluorocromos (BCECF, DCFH, SNARF...). En bacterias existe el problema de la pared que no es permeable a todos los fluorocromos utilizados en mamíferos. Después de diversas pruebas hemos comprobado que el fluorocromo más eficaz en nuestras células es el SNARF. Con él hemos realizado el seguimiento del pH a lo largo del crecimiento en distintos medios.