La citometría de flujo (CMF), desarrollada en un principio para fines biomédicos, se está utilizando cada vez más en el estudio de microalgas. Hasta el momento, esta técnica ha sido utilizada con buenos resultados en citoquímica, en estudios de la dinámica del ciclo celular y en ecología del fitoplancton. Un número especial de la revista Cytometry publicada en 1989, constituye una revisión bastante amplia de la importante utilización de la citometría de flujo y la separación celular en la investigación desarrollada en las ciencias acuáticas.

La determinación por CMF de los constituyentes celulares, como las distribuciones de ADN, el contenido de antígenos celulares o el análisis de pigmentos naturales como clorofilas o ficobiliproteinas, se ha llevado a cabo rutinariamente durante los £ltimos a¤os. Las medidas biofísicas de volumen celular eléctrico u óptico (FSC) y la granularidad celular óptica (SSC) se utilizan adicionalmente en estos estudios como ayuda para la caracterización celular. Estas medidas son £tiles en muchos casos, pero no permiten seguir los cambios funcionales de las células, como pueden ser los cambios en el pH intracelular, en la excitación celular o en la producción de energía. Debemos tener en cuenta que las células en general, y microalgas en particular, reaccionan ante determinadas condiciones mediante cambios en sus propias funciones y no necesariamente mediante cambios en sus constituyentes. Así pues, el conocimiento de los constituyentes no describe con demasiada precisión el estado de las células.

La determinación de las funciones celulares o fisiológicas ha sido difícil y limitada hasta hace poco tiempo ya que los microelectrodos tenían que ser introducidos en las células individuales, por ejemplo para los estudios del potencial de membrana o las medidas del pH intracelular. Las técnicas de CMF presentan importantes ventajas con respecto a los ensayos bioquímicos convencionales de actividades enzimáticas, particularmente porque las células pueden ser analizadas bajo condiciones cercanas a las fisiológicas.

Las células fitoplanctónicas oceánicas son en su mayoría unicelulares y rara vez miden más de unas pocas decenas de micrómetros de di metro, por lo cual son f cilmente analizadas en los equipos estándar de citometría de flujo. Estos microorganismos unicelulares marinos presentan una fuerte fluorescencia natural procedente de la clorofila o de otros pigmentos, como las ficobiliproteinas. El concepto b sico para la determinación por CMF de parámetros funcionales de microalgas marinas es determinar la fluorescencia de la clorofila por encima de 600 nm, simultáneamente a la fluorescencia de las tinciones funcionales por debajo de 600 nm. En el caso de la excitación UV entre 350 y 370 nm, la emisión fluorescente será recogida entre 390 y 500 nm.

Cuando la fluorescencia natural se produce en el mismo canal que el fluorocromo funcional, este colorante, dada su brillantez, todavía puede darnos información. La fluorescencia natural de cada grupo celular de la muestra control sin te¤ir debe ser sustraido de la fluorescencia observada en el mismo grupo celular pero en la muestra te¤ida.

Los ensayos funcionales o fisiológicos se llevan a cabo fácilmente mediante esta técnica. Después de la adicción de un nuevo fluorocromo o un cóctel de fluorocromos existe un tiempo de incubación, que oscila entre 1 y varios minutos. El la mayoría de los casos, las células pueden ser entonces analizadas o medidas inmediatamente después de la incubación, pero en algunos casos es necesaria una centrifugación seguida de una resuspensión en tampón o medio de cultivo sin teñir, con el fin de disminuir la concentración extracelular de fluorocromo y, por tanto, el ruido de fondo.

Hemos aplicado diferentes análisis funcionales por CMF al estudio de la fisiología de diferentes microalgas marinas expuestas a condiciones de estrés provocado por diferentes agentes toxicológicos. En este trabajo se muestran algunos resultados obtenidos del an lisis de la diatomea marina Phaeodactylum tricornutum expuesta a diferentes concentraciones de cobre. También se realizaron cultivos sin cobre, los cuales se utilizan como cultivos control. Los parámetros evaluados por CMF, utilizando un FACScan (Becton Dickinson Instruments) equipado con un láser de excitación de ion argón (488 nm) fueron: volumen celular, fluorescencia de la clorofila a, viabilidad celular, pH intracelular, actividad peroxidasa, así como potenciales de menbrana tanto plasm tica como mitocondrial. El estudio de algunos de estos parámetros requieren la utilización de diferentes fluorocromos específicos, con una emisión fluorescente estable en agua de mar, que se adicionaron a las alícuotas de los cultivos de esta diatomea.

Para cada una de las medidas ensayadas se analizaron al menos 104 células y las medidas de la fluorescencia se realizaron en la escala logarítmica. Los valores medios de fluorescencia para cada población fueron obtenidos utilizando el software del citómetro (LYSIS II program; Becton Dickinson Instruments)

Los resultados obtenidos han demostrado que la CMF es una herramienta eficaz en el estudio funcional de las microalgas. Esta técnica permite el estudio rápido y fácil de diferentes aspectos del comportamiento celular que serían difíciles de determinar mediante otras técnicas.