I. Caragol, M. Hernández t T. Español, Unidad de Inmunología; J.M. García-Arumí, Servicio de Oftalmología;J. Ferrer y J. de García, Servicio de Pneumología. Hospital del Valle Hebrón. Barcelona.
El estudio fenotípico de las poblaciones linfocitarias, mediante el marcaje con anticuerpos monoclonales y citometría de flujo (CMF), en los liquídos biológicos puede contribuir al diagnóstico de distintas patologías. La ventaja que ofrece esta técnica, en comparación con las de inmunohistoquímica estriba en la sensibilidad al analizar muestras en las que el número de células puede ser escaso y en la diligencia con la que se obtienen resultados. En esta comunicación resumimos nuestra experiencia en tres protocolos de estudio: humor vítreo (HV), líquido pleural (LP) y lavado broncoalveolar (LBA) en los últimos 18 meses. En todos los casos estudiados se ha procurado determinar los mismos marcadores linfocitarios en sangre periférica, y se ha realizado el estudio citológico. Al igual que en otro tipo de muestras, existen unos requerimientos mínimos en la calidad y cantidad para que los resultados del an lisis sean v lidos y £tiles. Por ejemplo, el estudio del humor vítreo ha sido imposible en algunos casos debido a la escasa celularidad de la muestra, comprobada asimismo por citología. Esta es la limitación principal con la que nos hemos encontrado, siendo posible mediante la CMF, por otro lado, el estudio de otras muestras también con escasa celularidad.
Objetivos: Valoración de la utilidad diagnóstica del estudio fenotípico por CMF de linfocitos en 1) humor vítreo, 2) líquido pleural, 3) lavado broncoalveolar en tres protocolos distintos en un periodo de 18 meses. (Diciembre 1993 - Abril 1995)
Objetivos particulares de cada protocolo:
1) Obtener marcadores diferenciadores de inflamación de origen infeccioso o inmunológico en las uveitis crónicas que han requerido cirugía por motivos terapéuticos.
2) Investigar si existen diferencias fenotípicas de los linfocitos en derrames pleurales en pacientes con pleuritis tuberculosa que se correspondan con dos patrones clínicos definidos. Comparación de estos con derrames pleurales en neoplasia pulmonar. 3) Diagnóstico etiopatológico u orientación diagnóstica en un grupo determinado de pacientes que presentan patrón radiológico intersticial. Buscar marcadores para diferenciar rechazo de infección en trasplantados pulmonares con patrón intersticial. En ninguno de los tres protocolos se ha dispuesto de controles sanos por razones obvias. El humor vítreo normal es acelular, el derrame pleural es patológico y las poblaciones linfocitarias en el lavado broncoalveolar en sujetos sanos están estudiadas por otros autores (1) y a estos nos referimos.
Materiales y Métodos: Se han estudiado 20 HV de 17 pacientes con uveitis que cumplían los criterios para la realización de una vitrectomía terape£tica; 23 LP de 20 pacientes con TBC, neoplasia pulmonar o inespecíficos; 40 LBA de 35 pacientes con patrón intersticial de diversa etiología. El HV fue recogido en jeringuilla de insulina y se disponía de 0,8 - 1 ml. de volumen total para el estudio de citometría. El LP fue recogido en tubos de EDTA disponiendo de un volumen de 3 ml. El lavado broncoalveolar para CMF correspondía a una alícuota de 30- 50 ml. del lavado con suero salino fisiológico. Antes del marcaje con anticuerpos monoclonales, los LBA se filtraron para descartar restos de mucosidades. A partir de este punto, todos los líquidos se centrifugaron, guardando el sobrenadante de los HV para determinación posterior de mediadores, decantaron, resuspendieron en PBS, alicuotaron y marcaron de la forma habitual para CMF. Algunos derrames pleurales requirieron lisado posterior por ser hemáticos. Todas las muestras fueron procesadas y analizadas en el citómetro en el día de la recogida.
Estudio fenotípico: En todos los casos se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales:
Control isotípico, CD45FITC, CD14PE, CD3FITC, CD19PE, CD16PE, CD56PE, DRPE, CD4FITC y CD8PE. En los LBA se incluyó además en los casos con sospecha de histiocitosis anti-CD1aPE. En el caso de los HV dado que el volumen era escaso y en función de la celularidad se marcaron con prioridad CD4/CD8 y CD3/DR. Los mismos marcadores fueron estudiados paralelamente en una muestra de sangre periférica.(sp)
Resultados:
1) En las uveitis estudiadas se observa un predominio de linfocitos T con expresión de DR con una media 39% (20-68) en el 77% de los casos. Comparando estas cifras con las de la sp la expresión de DR es de 2 a 30 veces superior en la humor vítreo. Los índices de CD4/CD8 en el HV fueron comparables a los niveles normales en sp en 3 casos (vitritis), inferiores a 0,8 en 4 casos (3 Behçet) y superiores 2,5 en 5 casos (uveitis intermedias o vasculitis retinales). En sangre los índices CD4/CD8 fueron normales en el 75% de los casos. 2) El diagnóstico de los pacientes cuyos LP fueron estudiados fue: 8 neoplasias, 4 TBC, 1 neoplasia +TBC y 3 derrames inespecíficos. En sp las poblaciones linfocitarias fueron normales en todos los casos menos en 3 en los que el índice CD4/CD8 fue < a 0,9. Los 3 casos eran neoplasias pulmonares. En los LP se observó un predominio de linfocitos T (>75%) en el 95% de los casos. El índice CD4/CD8 fue >2,5 en 10 (45%) de los 22 LP estudiados. De estos 6 eran neoplasias, 2 TBC y 2 inespacíficos. Los porcentajes de linfocitos T activados fueron superiores a 15 en 7 casos de los cuales 5 eran neoplasias y 2 eran TBC.
3) La sospecha diagnóstico en los pacientes con patrón intersticial motivo de este estudio del LAB han sido agrupadas en: Enfermedades autoinmunes sistémicas y vasculares (29%), Inmunodepresión (27%), Alveolitis extrínsecas (16%), Trasplante pulmonar (14%), Sarcoidosis (11%) e Histiocitosis X (4,5%). La distribución de las poblaciones linfocitarias en sp y LAB en sujetos sanos, son comparables seg£n varios estudios publicados. En nuestra serie observamos un predominio de linfocitos T (CD3+>75%) en sp en 37% de los casos y en el LAB en el 92%; un incremento de linfocitos T activados (CD3DR>15%) en sp en el 15% y en LAB en el 74%; un índice CD4/CD8 disminuido (<0,8) en sp en el 14% y en LAB en el 26%; un índice CD4/CD8 incrementado (>2,5) en sp en el 6% y en el LAB en un 8% de los casos.
Conclusiones: Como conclusión de este trabajo se puede confirmar la utilidad del estudio de los LAB en la orientación diagnóstica. Debido al n£mero reducido de casos estudiados de uveitis, LP en TBC y LAB en trasplante pulmonar no pueden sacarse conclusiones sobre los objetivos concretos. Estos son los resultados preliminares que en un futuro se podrán analizar con valor estadístico.
(1) Reuben M. Cherniack, coordinator. The BAL Cooperative Group Steering Committee. Am Rev Respir Dis. Suppl. 1990; 141: S169-S202.