F. Medina, C. Rodríguez, C. Segundo, A. Sampalo, J.A. Brieva.

Servicio de Inmunología. Hospital Universitario Puerta del Mar. Cádiz.

Introducción y Objetivos

Un elevado número de linfocitos B de germinal (CG) sufren apoptosis in vivo, lo que parece estar en relación con procesos de selección funcional. Los linfocitos B de CG sufren apoptosis espontáneamente en cultivo (60-80% de células en fase sub-Go a las 24 horas). En el presente trabajo se purificaron linfocitos B de CG (caracterizadas como células CD38+, CD20alto, IgD) y se estudiaron secuencialmente durante el primer día de cultivo valorando los cambios morfológicos y fenotípicos durante el proceso de apoptosis.

Metodología

La purificación de linfocitos B de CG se realizó combinando técnicas de formación de rosetas con hematíes de carnero, técnicas basadas en diferencias de densidad utilizando gradientes discontínuos de percoll y técnicas basadas en expresión diferencial de antígenos (Ag) de superficie utilizando anticuerpos monoclonales (AcMo) e inmunoselección magnética.

El estudio morfológico se realizó mediante citometría de flujo valorando los par metros de forward scatter y side scatter. El an lisis de Ag de superficie se realizó utilizando AcMo específicos mediante técnicas de inmunofluorescencia directa e indirecta y se valoró mediante citometría de flujo. La apoptosis de la población de CG se estimó mediante citometría de flujo y tinción con ioduro de propidio.

Resultados

1. Las células CG muestran un cambio progresivo (notable a partir las 12 horas) consistente en disminución del forward scatter y aumento del side scatter, demostrándose que las células con estas características mostraban DNA fragmentado. 2. Se analizaron varias moléculas de membrana definiéndose dos patrones de cambio: CD19, CD20, CD38 y DR no modificaban significativamente su expresión en el periodo de estudio. Sin embargo, CD21, CD22, CD40, CD11a, CD45 y CD54 disminuían su expresión continuamente durante ese periodo, siendo claramente notable dicho descenso a partir de las primeras 6 horas de cultivo. La adición al cultivo de estímulos que rescatan a las células CG de la apoptosis, como AcMo anti-CD40 + IL-4 + SAC, también retrasaba los cambios descritos.

Estos datos sugieren que el descenso temprano de la expresión de moléculas de adhesión, de supervivencia y de CD45 sobre las células CG puede reflejar el inicio del proceso de apoptosis de las mismas.