R. García del Moral Garrido, A. Olmo Sevilla y M. Andújar Sánchez
FENÓMENO MDR: GENERALIDADES
Uno de los principales problemas del tratamiento quimioterápico del cáncer es la resistencia que las células tumorales presentan frente a los fármacos utilizados, ya sea antes, durante o después de la terapéutica. Este fenómeno, que en principio aparece en las células frente a un determinado fármaco, en muchas ocasiones lo desarrollan de manera cruzada con otros compuestos. El primer acercamiento a este fenómeno fue realizado en los años 70 por Biedler y Riehm (1970) en células de hámster que seleccionadas por su resistencia a Actinomicina-D, desarrollaron simultáneamente resistencia frente a Vincristina, Vinblastina y Daunomicina. Este fenómeno se denominó "Multidrug Resistance" (MDR).(Marx, 1986; Gottesman & Pastan, 1988; Dietel, 1991; Gottesman MM & Pastan, 1993; Biedler, 1994; Simon & Schindler, 1994; Harrison, 1995).
Los mecanismos bioquímicos y celulares conocidos que se creen implicados en la MDR son muy variados, y entre ellos destaca la expresión de una glicoproteína de 180,000 y 170,000 kD según su isotipo denominada genéricamente Gp-P.
GENÉTICA DE LA GLICOPROTEÍNA P
Los estudios de biología molecular han demostrado que los genes que codifican la Gp-P (genes mdr, en humanos MDR1 y MDR2 -Roninson et al., 1986) se localizan en la banda q21-1 del cromosoma 7 (Callen et al., 1987).
Un gen relacionado con los anteriores es el MDR3, descrito por van der Bliek et al.(1987). La proteína derivada de este gen tiene una secuencia homologable a la del MDR1 en un 80% (van der Bliek et al., 1987). La asociación de estos genes ha sido estudiada en varios tipos de leucemias. Herweijer et al. (1990) demuestran que el MDR1 se expresa en todos los tipos de leucemias excepto en la B-PLL, y que el del MDR-3 lo hace tan sólo en las leucemias de origen B.
Todos los genes descritos están relacionados con otros de estructura similar que codifican proteínas diversas como adenilciclasas, el regulador transmembrana de la fibrosis quística, sistemas de transporte de proteínas y de presentación de antígenos en el retículo endoplásmico rugoso, en los peroxisomas; también se ha encontrado en otras especies animales y vegetales, como esponjas marinas, plantas, peces, parásitos como los nematodos, Plasmodium phalciparum, Leishmania, bacterias y otros seres vivos por lo que se ha generalizado el concepto de una "superfamilia de transportadores de membrana dependientes de ATP" o "superfamilia ABC" (Higgins, 1992).
La capacidad de una célula tumoral de sobreexpresar los genes relacionados con la MDR puede adquirirla antes de someterla a la acción de agentes externos como los quimioterápicos (adquisición "per se") o desarrollarla durante el tratamiento o la exposición a los fármacos. La adquisición "per se" podría explicarse considerando la posible activación de un oncogenes que indujeran la expresión y sobreexpresión de los genes MDR, como se ha podido demostrar en modelos experimentales de hepatocarcinogénesis en ratas, las cuales al desarrollar un hepatocarcinoma aumentaban la expresión de genes MDR y sus proteínas Gp-P a nivel del hepatocito varias veces superior al control (Teeter et al., 1993).
Con estos antecedentes se han realizado trabajos que estudian gran cantidad de neoplasias diferentes para conocer el grado de presencia de los genes MDR, así como su sobreexpresión mediante "slot dot". Goldstein et al. (1989) utilizando esta técnica mapearon más de 400 casos de cáncer y de sus resultados dividieron a los tumores no tratados en:
BIOQUÍMICA Y FISIOLOGÍA DE LA GLICOPROTEÍNA P
La parte protéica de la Gp-P es un polipéptido de 1280 aminoácidos que está compuesto por dos partes aproximadamente iguales que son homólogas entre sí, el segmento N-terminal (residuos 1-637) y el fragmento C-terminal (residuos 638-1280). Cada uno contiene un dominio hidrofóbico y otro hidrofílico. Cada dominio hidrofóbico contiene seis segmentos situados en el espesor de la membrana. El dominio hidrofílico cuenta con fragmento tanto en el exterior como en el interior celular donde existen dos pares de fragmentos que pueden ligarse a los nucleótidos del ATP lo que sugiere un lugar de unión de ATPasa, y por tanto una función energía dependiente (Versantvoort et al., 1992).
Un hecho significativo es que para diferentes líneas celulares que expresan mdr+, las resistencias cruzadas son a grupos diferentes de fármacos, y así la sustitución del aminoácido Glicina situado en lugar 185 por Valina hace que las células presenten resistencia preferencial a la Colchicina, no afectando esta mutación al locus donde se unen las sustancias a la glicoproteína pero sí afecta a la expulsión de éstas desde el interior celular (Safa et al., 1990).
Todas estas características bioquímicas y enzimáticas se han relacionado y estudiado comparativamente con enzimas bacterianas pericitoplásmicas, encontrándose homologías que apoyan la concepción de una Gp-P que vierte al exterior sustancias intracelulares a modo de bomba ATP dependiente (Gros et al 1986).
Otra actividad enzimática caracterizada para la Gp-P es como canal del Cloro, ATP dependiente regulados por volumen, de manera similar a regulador transmembrana de la fibrosis quística (Gill et al., 1992).
Funcionalmente la Gp-P actúa según el modelo desarrollado por el equipo de Gottesman y que denominan "limpiador de componentes hidrofóbicos" (hydrophobic vacuum cleaner), a manera de bomba que reconoce y expele sustancias de dos modos: a) desplaza sustancias situadas sobre o dentro de la membrana antes de que logren penetrar en la célula, por lo cual disminuye el influjo de sustancia, y b) expulsaría aquellas sustancias que no se vieran afectadas por el primer mecanismo (Gottesman, 1993). Las sustancias que se ven afectadas por el fenómeno mdr son en general hidrofóbicas, y muchas de ellas cargadas positivamente. Entre los quimioterápicos están: Actinomicina D, Daunorrubicina, Doxorrubicina, Colchicina, Vincristina, Vinblastina, Etopósido, Tenipósido, Mitomicina, Mitramicina. Pero el espectro de sustancias se amplía progresivamente describiéndose también para digoxina y hormonas esteroideas como el cortisol, dexametasona, y mineralcorticoides como la aldosterona (Ueda et al., 1992).
PRESENTACIÓN EN TEJIDO Y TUMORES. INMUNOHISTOQUÍMICA.
En tejidos normales la Gp-P tiene una distribución desigual pero se expresa en mayor proporción en aquellas células que tienen una función secretora, sobre todo de sustancias hidrófobas. Podemos citar las siguientes (Cordon-Cardó et al., 1990): la cara biliar del hepatocito, en las células de los canalículos pancreáticos, en el borde en cepillo de las células del túbulo proximal, en la mucosa del yeyuno y del colon, en la glándula adrenal tanto de la corteza como de la médula, en los capilares del sistema nervioso central, lo que ha relacionado a la Gp-P con la barrera hematoencefálica, y en diferentes tejidos fetales en los que se aprecia una progresiva detección conforme avanza el desarrollo. Recientemente y como se comentará en otra ponencia se ha descrito su expresión constitutiva en linfocitos.
MODULACIÓN FARMACOLÓGICA DEL FENÓMENO MDR.
Desde las primeras descripciones de la Gp-P y su base genética, se han estudiado otros fármacos, sobre todo calcioantagonistas y más modernamente ciclosporina A y otros inmunosupresores, que interfieren con la expresión y funcionalismo de esta glicoproteína. Los compuestos que tiene una acción inhibitoria sobre la función de expulsión de la Gp-P se dividen en:
POSIBILIDADES DE ESTUDIO DEL FENÓMENO MDR VINCULADO A GLICOPROTEÖNA P
Dada la influencia del fenómeno MDR dependiente de la glicoproteína P sobre el tratamiento antitumoral, desde antiguo se ha planteado su estudio mediante muy diferentes métodos. Con la introducción de los modernos citómetros de flujo y de numerosos anticuerpos monoclonales que reconocen a Gp-P, esta metodología se ha ido introduciendo progresivamente sobre todo en la evaluación de las neoplasias hematológicas. Sin embargo, las dificultades técnicas que plantea el procedimiento inmunofluorescente de determinación hace que sigan planteándose diversas alternativas al mismo como los procedimientos basados en inmunohistoquímica o biología molecular.
En función de todo lo expuesto, el objetivo de esta ponencia es mostrar un estudio comparativo de los distintos procedimientos susceptibles de aplicación para identificar la Gp-P así como sus ventajas e inconvenientes.
El modelo elegido para exponer dicho estudio parte de la hipótesis esbozada por nuestro grupo de que la aparición de nefrotoxicidad inducida por CsA es pacientes trasplantados podría depender de una respuesta defectuosa por parte del mecanismo enzimático detoxificante del túbulo renal vinculado a la Gp-P. La hipótesis surgió a partir de la observación de que en biopsias renales postrasplante existe asociación entre los depósitos de CsA y la sobreexpresión de P-gp (Test de Spearman, r=0.577, p<0.001)- García del Moral et al, 1995-.
El hecho de que la intensidad de los depósitos intracelulares no se correlacione con los niveles séricos de CsA aboga a un posible papel de susceptibilidad individual de expresión de la Gp-P en respuesta a la agresión farmacológica (Lemaire et al, 1990), hipótesis que podría explicar la aparición de nefrotoxicidad al no activarse la bomba detoxicante en algunos individuos y por el contrario, la aparición de crisis de rechazo resistentes a CsA en pacientes con una respuesta excesiva de P-gp en los linfocitos CD4 (Gómez-Morales et al, 1995).
Para confirmar experimentalmente esta hipótesis, se planteó utilizar un modelo in vivo sobre ratas y otro in vitro en la línea MDCK de túbulo renal perro.
El modelo "in vivo" se realizó en ratas, a partir de un estudio de toxicidad crónica (5 meses de tratamiento con CsA a dosis de 8 mg/kg/día). El fármaco se inoculó en bombas de infusión osmótica renovadas cada 28 días. Durante las experiencias, las ratas se estabularon en jaulas metabólicas, con apertura de ventanas cada 15 días para bioquímica convencional y de función renal en sangre y orina, niveles séricos de CsA, estudio de subpoblaciones linfocitarias y valoración de endotelina plasmática. En la autopsia por grupos mensuales, se tomaban muestras renales para estudio de biología molecular (Northern Blotting y Western Blotting de la Gp-P) e inmunohistoquímica convencional.
Mediante inmunohistoquímica sobre secciones de tejido congelado utilizando un método convencional de fosfatasa-antifosfatasa alcalina (Masson, 1985), la Gp-P se detectó en el borde en cepillo de los túbulos corticales mientras que los túbulos de la medular son totalmente negativos, como lo son también el glomérulo y los endotelios vasculares. Sin embargo existe una positividad en las células musculares lisas de las paredes vasculares.
Sin embargo al tratar de realizar este procedimiento sobre tejido incluido en parafina, la inmunotinción desaparecía, por lo cual se decidió intensificar la inmunotinción mediante reincubación con el anticuerpo secundario y complejo FAAFA, tal y como ha sido descrito con anterioridad (Elias 1990). Además fue necesario un bloqueo sistemático de la actividad fosfatasa alcalina endógena incluyendo dosis más elevadas de Levamisol que las habitualmente empleadas e incluir controles externos positivos y la valoración como control interno de la positividad en macrófagos así como la consideración de única tinción válida la de membrana citoplasmática, con exclusión expresa de la tinción citoplásmica difusa. Todo ello originó grandes dificultades en la realización del procedimiento así como fenómenos de sobretinción no específica y fundamentalmente, imposibilidad de cuantificar de forma objetiva los resultados. En gran medida consideramos que todos estos problemas se derivan tanto por la inactivación antigénica de la Gp-P a consecuencia del procedimiento de fijación e inclusión del tejido como de la necesidad de aplicar una gran amplificación inmunohistoquímica para demostrar el escaso número de epítopos preservados de Gp-P tras el procesamiento histológico.
En lo que se refiere al procedimiento de Western-blotting como alternativa al método inmunohistoquímico, la principal dificultad metodológica encontrada en la optimización del procedimiento fueron los bajos niveles de Pg-P existentes a nivel renal en los animales control, un hecho que había sido descrito previamente tanto por Northern blotting como mediante hibridación "in situ" de su ARNm (Popescu et al, 1993, Brown et al, 1993). En este sentido el trabajo fundamental realizado sobre tejidos murinos señala que el órgano con mayor riqueza de transcripción del gen mdr1b es el hígado, encontrándose el riñón entre los tejidos más pobres en Gp-P. Este es un hecho diferencial fundamental respecto a la especie humana donde el ri¤ón junto a la glándula suprarrenal son los que más cantidad de proteína contienen (Cordon- Cardó et al, 1990).
Por los motivos expuestos, los primeros ensayos de Western blotting realizados mediante procedimiento indirecto de amplificación utilizando peroxidasa como enzima trazador fueron escasamente relevantes. De forma similar a lo realizado para el procedimiento inmunohistoquímico de detección de Gp-P, se modificó el método de Western blotting, en el sentido de incorporar una mayor amplificación sustituyendo el procedimiento indirecto mediante anticuerpo secundario marcado por otro basado en una triple incubación colocando el anticuerpo secundario no marcado en exceso y un complejo de fosfatasa-antifosfatasa alcalina. Para disminuir el fondo inespecífico se incorporó un bloqueo con caseína a la máxima concentración permitida por el procedimiento (Tòth et al, 1994). Después de las modificaciones descritas se consiguió obtener una débil se¤al basal de Gp-P en la trasferencia de los geles con presencia de escasa coloración inespecífica de fondo. Debido a ello y para conseguir incrementar el nivel de gris necesario para la lectura digital de las bandas transferidas se decidió cargar los geles con el máximo posible de proteínas (160 µg/calle).
Todo ello nos ha permitido demostrar que la CsA induce sobreexpresión de Gp-P en riñón de rata y que además existen variaciones individuales entre los animales ratas, probablemente vinculadas a heterocigosidad de los genes MDR de forma similar a lo descrito para el citocromo P450.
En lo que se refiere al procedimiento de Northern blotting para identifica el ARNm de la Gp-P, la utilización del mismo sobre ARN total no es lo suficientemente sensible para reconocer las sutiles variaciones inducidas por lo que se requiere un método de protección frente a ARNasa de difícil montaje y con problemas técnicos que en la actualidad estamos tratando de resolver. Por todo ello, este modelo que ha sido muy útil para obtener conclusiones generales sobre la nefrotoxicidad de la CsA, nos ha supuesto un costo económico extraordinario además de considerable esfuerzo.
Por el contrario, el modelo in vitro y sobre el cual se habían depositado menores expectativas, rápidamente produjo resultados y ello en gran medida por al posibilidad de emplear un procedimiento de citometría de flujo para cuantificar la Gp-P, que si bien tubo que ser optimizado, en la actualidad es reproducible y relativamente sencillo de aplicar como se comentará en otra ponencia de este Workshop. Este modelo "in vitro" se realizó en condiciones estándar de cultivo, induciendo una estimulación crónica de la línea MDCK con CsA a dosis de 1µg/ml y realizando determinaciones de P-gp con AcMos mediante citometría de flujo a los 7, 30, y 60 días postratamiento. La experiencia demostró un aumento progresivo de los niveles basales de gp-P, tanto en número de células positivas, como en intensidad de fluorescencia, siendo más marcado el incremento en el paso de 30 a 60 días (García del Moral et al, 1995).
Como conclusiones finales puede decirse que el experimento in vitro supuso un coste medio inferior al 500% sobre el modelo in vivo así como una considerable simplificación técnica y ahorro de tiempo.
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